小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)

完全培養(yǎng)基: 高糖DMEM (GIBCO 12430); 15%胎牛血清(BIOCHROM S0615); 0.1 mmol/L非必需氨基酸(GIBCO 11140-050); 2 mmol/L谷氨酰胺(GIBCO 25030); 0.1 mmol/L β-巰基乙醇(GIBCO 21985); 1 000 U/ml白血病抑制因子(CHEMICON ESG1107)

凍存液: 90%胎牛血清或完全培養(yǎng)液; 10%二甲基亞砜(DMSO, Sigma D2650)

一 小鼠胚胎干細胞復(fù)蘇

1. 操作前把培養(yǎng)液在37 ℃水浴中溫?zé)帷?

2. 從液氮中取出一支凍存管的小鼠胚胎干細胞, 放入37 ℃水浴中晃動, 直到只剩下小冰晶。

3. 吸取凍存管內(nèi)的細胞懸液加至有少量完全培養(yǎng)液的15 ml 離心管中, 1 000 r/min 離心5 min。

4. 吸棄上清液, 加4~6 ml 培養(yǎng)液, 吹打懸浮。

5. 重復(fù)吹打, 制成單細胞懸液, 盡量避免氣泡。

6. 轉(zhuǎn)移到1個已經(jīng)鋪好飼養(yǎng)層的25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

7. 每天換液。

要點: 復(fù)蘇過程中“速融”是關(guān)鍵。由于在常溫下DMSO 對細胞有毒性, 應(yīng)盡量縮短復(fù)蘇的時間。離心去掉DMSO。